Muzejní sbírka ve své rozmanitosti odráží charakter a často značně různorodé zájmy různých správců, ředitelů a ředitelek a vedoucích muzea. Jejich rozšiřování bylo v průběhu času spíše náhodné, probíhalo prostřednictvím darů a odkazů, méně sbírkotvornou činností. V současnosti probíhá doplňování sbírky na základě sbírkotvorné koncepce. Soustředíme se především na předměty, které mají vazbu k našemu regionu.
Zásluhu na vzniku podsbírky mají dva místní sběratelé. Václav Procházka (1902–1983), učitel fyziky, chemie, matematiky a pozdější ředitel Buttulovy školy, věnoval muzeu vlastní sbírku, kterou vytvořil převážně v padesátých a šedesátých letech. Otto Nevole (1921–1999), též učitel a ředitel školy, paleontolog, fotograf a ochránce přírody, přispěl do geologické podsbírky cennými nálezy otisků mořských živočichů.
Geologická podsbírka obsahuje více než 800 exponátů. Jsou mezi nimi minerály a horniny z nejbližšího okolí Chotěboře, například z okolí skalního útvaru Koukalky, z údolí Doubravy, z lomu od Habrů, od Uhelné Příbrami nebo ze Starého Ranska. Nálezy různobarevných fluoritů a dalších minerálů pocházejí z okolí bývalého dolu u Běstviny. Důlní těžbu dokumentuje sbírka vrtných jader, což jsou tělesa válcovitého tvaru, tvořená vzorkem horniny získaným z geologického vrtu. Pocházejí z různé hloubky, většinou kolem sta metrů. Zkameněliny byly nalézány od druhé poloviny 40. let, většinou při kopání základů staveb. Pocházejí z období druhohor, z období před sto miliony let, kdy bylo v Čechách poslední moře. K nejvýznamnějším patří zkamenělé schránky loděnek, mořských hlavonožců (lat. Nautilus).
Nejrozmanitější podsbírka muzea pokrývá období od paleolitu po současnost. Je vytvářena od vzniku muzea v roce 1885 do dnešní doby, z velké části díky darům. Obsahuje předměty dokumentující historii muzea a Chotěbořska, exponáty z oblasti uměleckých řemesel a lidové tvořivosti, předměty dokumentující průmyslovou výrobu, předměty každodenní potřeby, vztahující se k činnosti místních cechů a spolků jako jsou cechovní knihy, prapory nebo výroční zprávy, části školních sbírek, exotické exponáty získané cestovateli, sekci militaria, látky a textilie, zemědělské náčiní, hudební nástroje, exponáty z oblasti zoologie, botaniky, archeologie, sfragistiky (pečeti), filatelie, nábytek či předměty, vztahující se k životu místních osobností. Historická podsbírka obsahuje přes 4000 exponátů.
Mezi cenné exponáty z nejstarší doby patří pravěké škrabadlo, nalezené na panském poli za Vlasárnou v Chotěboři, žebro, zub a kost mamuta, hrot pazourkového kopí z Dolní Krupé, amfora z doby bronzové (snad z Uhelné Příbrami) či kus kroužkové košile z doby husitství. Z novější doby například prsten z dělostřeleckého granátu, kafemlejnek a další výrobky z ranenské litiny nebo taktovka či vyšívaná záložka hudebníka a učitele Františka Buttuly.
Podsbírka knih je součástí sbírky od založení muzea. Soustředí se zejména na publikace z regionu z oblasti původního okresu Chotěboř. Jejím základem byla Knihovna dobrých spisů, kterou založil a organizoval Musejní spolek. První správce Josef Václav Neudoerfl do sbírky věnoval vlastní knihy a získal knihy z první veřejné knihovny v Chotěboři, kterou založil Vincenc Emanuel Libánský v roce 1843. Součástí podsbírky jsou publikace od prvotisků z 15. století do současnosti. Nejstarším exponátem je bible z roku 1488, tištěná v Praze, kterou muzeu věnoval kněz a básník František Xaver Boštík. Sbírka obsahuje množství starých tisků (z období 1501–1800). Nejobsáhlejší je oblast církevních knih, kam spadají sbírky kázání, modlitební knížky či bible. Knihy s regionem souvisejí tematicky, autorstvím, místem vydání, některé jsou cenné především jako doklad osobních knihoven chotěbořských osobností.
Ochrana knižního fondu je komplikovaná, knihy netvoří pouze křehký papír, ale i další materiály – knižní vazby obsahují prvky z kůže, textilu, dřeva či kovu. Postupně čištěné a restaurované knihy jsou ukládané v krabicích z nekyselého papíru. Kromě sbírkové má muzeum též příruční knihovnu. Knih je ve sbírce více než 2400.
Základy podsbírky byly položeny již při vzniku Městského muzea v Chotěboři v roce 1885. Jeden z prvních přírůstků muzea byla sbírka mincí Josefa Václava Neudoerfla, pořízená za patnáct zlatých. Sbírka vznikala od počátku nahodile, zprvu především díky četným darům. Své mince muzeu věnovali Antonín Wágner, purkmistr Felix Hubáček, spisovatel a učitel Karel Ninger, Antonín Šulc, předseda záložny František Jonáš a další.
Součástí podsbírky jsou mince antické, které patří k nejhodnotnějším, mimo jiné řecké, římské a makedonské. Dále mince z Osmanské říše (dnešního Turecka) nebo z Egypta, středověké a novověké mince (například vzácné krejcary Fridricha Falckého z roku 1620). Ve sbírce jsou též novodobé pamětní mince, bankovky především z období první republiky a z let 1939–1945, zahraniční mince z celého světa a žetony. Je zde také velké množství nouzových bankovek, především z doby kolem roku 1920. Součástí je sbírka faleristická (medaile, řády, vyznamenání, odznaky). Jedním z nejnovějších přírůstků jsou například odznaky z Chotěbořských strojíren.
Nejrozsáhlejší podsbírka obsahuje více než sedmnáct tisíc exponátů a dokumentuje období od 18. století po současnost. Byla tvořena a doplňována od vzniku muzea v roce 1885 a četné přírůstky přibývají i v současnosti. Podsbírka dokumentuje především historii města Chotěboře a regionu. Obsahuje rukopisné písemnosti, kroniky, dopisy, fotografie a pohlednice, mapy a plány, noty či památníky, místní noviny či výroční zprávy spolků nebo škol, plakáty, brožury, kalendáře a legitimace.
Patří sem například cenná korespondence Jindřicha Pruchy s otcem, matkou a sestrou, dopisy a pohlednice Otakara Rykra synu Zdenkovi, dopisy Ignáta Herrmanna, Františka Ladislava Riegra či Terezy Dubrovské Koseové, rukopisy chotěbořských vzdělanců a učitelů (Josef Václav Neudoerfl, Čeněk Houba a mnozí další).
Podsbírka obsahuje díla z období od 17. do 21. století: obrazy, kresby a grafiky, dřevěné, kamenné a sádrové plastiky, lidové malby na skle, vyšívané obrazy či koláže. V roce 1955 věnoval Otakar Rykr muzeu obrazy a kresby svého syna Zdenka Rykra. V letech 1966 a 1973 věnovala Vojslava Pruchová soubor prací svého bratra Jindřicha Pruchy, zejména kresby a skicáře. V muzeu je i rozsáhlá Pruchova korespondence a jeho pozůstalost, která se do muzea dostala po smrti Vojslavy přímo z jeho bývalého ateliéru na Župandě u Běstviny. Tyto soubory patří k nejcennějším a mají nadnárodní význam. Čtrnáct asambláží, které tvořily součást Rykrovy pozůstalosti, bylo bohužel v 70. letech převedeno na základě rozhodnutí kulturní komise města do majetku Národní galerie. Unikátní je také soubor více než 1200 fotografií (většinou s negativy), které vytvořil na přelomu 90. a nultých let Petr Helbich velkoformátovými fotoaparáty a zachycují město Chotěboř i jeho okolí.
Také další práce ze sbírky se vztahují k Chotěboři a okolí, například malby Jiřího Horníka s náměty ze Železných hor, okolí řeky Doubravy a Starého Ranska nebo rozsáhlý konvolut od Miroslava Paráka, získaný z pozůstalosti. Ve sbírce jsou grafiky Miloslava Pečinky, který učil na místní základní umělecké škole, Oldřicha Karla nebo Karly Matějíčkové s náměty řeky Doubravy, dále malby na skle a kresby chotěbořského karikaturisty Vlastimila Koštíře.
Sochařská část obsahuje práce Karla Opatrného z první poloviny 20. století, především portréty a návrhy a skici pomníku Ignáta Herrmanna. Dřevěné polychromované sochy sv. Václava a Ludmily ze 17. století pocházejí snad ze zámku v Nové Vsi, stejně jako plátno z roku 1887 zachycující děti rodiny Mixovy včetně budoucí básnířky Terezy Dubrovské.
Na dílech se negativně podepsalo nevhodné uložení na zámku. V roce 2013 iniciovala kurátorka Pavla Benešová záchranu exponátů, postupně se podařilo ty nejcennější restaurovat a vyčistit.
